Одной из серьезных проблем микроядерного теста является то, что исследования проводятся с использованием различных ядерных красителей, что может отразиться на результатах проводимых экспериментов. Решение данной проблемы является одной из самых приоритетных задач проекта HUMN XL (http://www.humn.org).

Нами (Калаев, 2010, 2012в) было проведено исследование влияния типа красителя (орсеина, светлого зеленого, метиленового синего, азур-эозина по Романовскому-Гимза) на частоту встречаемости клеток с аномалиями ядра (микроядрами, насечками, перинуклеарными вакуолями, протрузиями типа «язык» и «разбитое яйцо») в буккальном эпителии человека. Соскобы проводили 4 раза с интервалом в 3 дня у 10 здоровых спортсменов (за 3 дня до соревнования, во время соревнования и спустя три дня после соревнования).

Число клеток с микроядрами, перинуклеарными вакуолями, протрузиями типа «язык» (только в 1 повторности), а также число аберраций всех типов зависело от способа окрашивания (табл. 1). Влияния окрашивания на встречаемость других типов нарушений не отмечено.

БУККАЛЬНЫЕ ЭПИТЕЛИОЦИТЫ ЧЕЛОВЕКА, ОКРАШЕННЫЕ РАЗЛИЧНЫМИ ВИДАМИ КРАСИТЕЛЕЙ

Было выявлено изменение спектра нарушений в зависимости от используемого ядерного красителя (рис. 12, 13, 14, 15).
Рис. 12. Спектр цитологических нарушений в клетках буккального эпителия человека при окрашивании орсеином	Рис. 13. Спектр цитологических нарушений в клетках буккального эпителия человека при окрашивании светлым зеленым
Рис. 14. Спектр цитологических нарушений в клетках буккального эпителия человека при окрашивании метиленовым синим	Рис. 15. Спектр цитологических нарушений в клетках буккального эпителия человека при окрашивании азур-эозином по Романовскому-Гимза

Наибольшая частота клеток с микроядрами отмечалась при окрашивании азур-эозином по Романовскому-Гимза (49,8 %), наименьшая – светлым зеленым (13,4%) (различия достоверны (Р<0,001)). Промежуточные значения частоты встречаемости клеток с микроядрами выявили для орсеина (26,2 %) и метиленового синего (16,2 %).

В результате проведенных исследований рекомендован краситель азур-эозин по Романовскому-Гимза как лучший из протестированных для выявления клеток с микроядрами.

Перинуклеарные вакуоли преобладали в спектре нарушений при окрашивании светлым зеленым (78 %), наименьшую их частоту отмечали при окрашивании азур-эозином по Романовскому-Гимза (31,2%) (различия достоверны (Р<0,001)). Промежуточные значения встречаемости клеток с перинуклеарными вакуолями отмечались для орсеина (51,9 %) и метиленового синего (51 %). Таким образом, светлый зеленый может быть рекомендован для определения перинуклеарных вакуолей.

Протрузия типа «разбитое яйцо» чаще встречалась в спектре при окрашивании метиленовым синим (8,8 %), наименьшие значения указанной патологии отмечали при окрашивании азур-эозином по Романовскому-Гимза (3,6 %), орсеином (4,8 %) (различия с метиленовым синим достоверны (Р<0,01)), светлым зеленым (3,4 %) (различия с метиленовым синим достоверны (Р<0,001)). На основании этого возможно утверждать, что метиленовый синий позволяет лучше идентифицировать протрузии типа «разбитое яйцо».

Протрузии типа «язык» чаще отмечаются при окрашивании метиленовым синим (10,4 %), азур-эозином по Романовскому-Гимза (8,6 %), орсеином (6,5 %), наиболее редко – светлым зеленым (3,5 %) (различия с метиленовым синим и азур-эозином по Романовскому-Гимза (Р<0,001) и с орсеином (Р<0,01) достоверны). Поэтому можно говорить, что все красители, кроме светлого зеленого, эффективны для определения протрузий типа «язык».

Наибольшее количество клеток с насечками отмечается при окрашивании метиленовым синим (13,5 %), орсеином (10,5 %), наименьшее – при окрашивании светлым зеленым (7,9 %) (различия достоверны (Р<0,05)). Промежуточные значения встречаемости клеток с насечками отмечали при окрашивании азур-эозином по Романовскому-Гимза (8,2 %). Таким образом, орсеин и метиленовый синий позволяют лучше выявлять насечки.

На основании выполненного анализа числа и спектра клеток с нарушениями морфологии ядра нами (Калаев и др, 2010, 2012в) было констатировано, что одни красители будут более эффективны для поиска одного типа нарушений и менее эффективны — для поиска других. Однако, по нашему мнению, из всех изученных красителей наиболее оптимален для окраски клеток буккального эпителия азур-эозин по Романовскому-Гимза, т.к. он позволяет получить качественные препараты для микроскопического исследования, выявить наибольшее количество нарушений и в достаточной мере раскрывает их спектр (лучшие результаты по выявлению клеток с микроядрами, протрузиями типа «язык» и промежуточные значения для протрузий типа «разбитое яйцо»).

Следует отметить, что во всех случаях не было отмечено влияния индивидуальных особенностей человека на результаты окрашивания, т.е. не было выявлено групп людей, в которых для обнаружения какого-либо нарушения был бы эффективен один вид красителя, и групп, где указанный краситель для обнаружения этого же типа нарушения неэффективен. Таким образом, один и тот же краситель на клетках разных людей позволяет выявить сходные спектры аберраций (Калаев, 2008; 2010).

Ayyad (Evaluation of Papanicolaou …, 2006) и Palaskar (2010) было проведено сравнение красителей Папаниколау и Май-Грюнвальд-Гимза. Выявлено преимущество окрашивания по Папаниколау, так как получаются более качественные препараты по сравнению с красителем Май-Грюнвальд-Гимза, при окрашивании которым микропрепараты оказываются более загрязненными посторонними включениями.

Большинство зарубежных авторов рекомендует окрашивать препараты по Фельгену (The micronucleus assay … , 2008; Buccal micronucleus cytome … , 2009; State of the … , 2009), так как при этом возможно применение флуоресцентной и световой микроскопии, и данное окрашивание позволяет исключить артефакты. Grover et al (A comparative study …, 2012) провели сравнение частоты встречаемости микроядер у больных красным плоским лишаём, лейкоплакией и подслизистым фиброзом ротовой полости при окрашивании по Фельгену, Папаниколау, гематоксилином и эозином.

При использовании всех типов красителей были выявлены различия между контрольной и опытной группами, причем при окрашивании по Фельгену получились самые низкие результаты, как в контрольной, так и в исследуемой группе (различия достоверны (P<0,01)) (окрашивание по Фельгену: контрольная группа – 1,6 ± 1,2 ‰, с заболеваниями полости рта – 3,8 ± 1,4 ‰ (различия достоверны (P<0,01)); окрашивание по Папаниколау: контрольная группа – 7,7 ± 2,0 ‰, с заболеваниями полости рта – 16,8 ± 5,6 ‰ (различия достоверны (P<0,01)); окрашивание гематоксилином и эозином (контрольная группа – 9,6 ± 2,3 ‰, с заболеваниями полости рта – 25,9 ± 6,7 ‰ (различия достоверны (P<0,01))). Авторы связывают полученные результаты с ДНК-специфичностью окрашивания по Фельгену, и исключением при этом типе окрашивания артефактов. Но в связи с тем, что достоверные различия были найдены при использовании всех четырех типов красителей, а окрашивание по Фельгену более трудоемко по сравнению с другими способами, авторы не отдают предпочтение тому или иному красителю, а советуют продолжить и расширить исследования в данном направлении.

Nersesyan et al (Effect of staining … , 2006; Nersesyan, 2006) также указывают на то, что способ окрашивания препарата оказывает влияние на результат. Они разделяют методы окрашивания на неспецифические (красители Гимза, Май-Грюнвальд-Гимза) и ДНК-специфические (окрашивание по Фельгену, акридиновым оранжевым) и утверждают, что использование неспецифических красителей ведет к ложным результатам.

Таким образом, наиболее приемлемым является окрашивание цитологических препаратов ДНК-специфическими красителями, однако в случае отсутствия возможности их использования целесообразнее окрашивание азур-эозином по Романовскому-Гимза, так как данный краситель позволяет получить достаточно качественные, пригодные для просмотра препараты и выявить наибольшее число ядерных нарушений (Калаев, 2008; 2010). Во всяком случае, необходимо отметить, что данная проблема нуждается в серьезной доработке и расширении спектра применяемых красителей.